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Síntese convergente de oligonucleotídeos fosforodiamidato morfolino (PMOs) pelo H

Oct 15, 2023Oct 15, 2023

Scientific Reports volume 13, Artigo número: 12576 (2023) Citar este artigo

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Os oligonucleotídeos morfolino fosforodiamidato (PMOs) são um tipo promissor de oligonucleotídeos antisense, mas sua síntese desafiadora os torna de difícil acesso. Esta pesquisa apresenta uma abordagem sintética eficiente para PMOs utilizando a abordagem H-fosfonato. O uso de reagentes de condensação do tipo fosfônio reduziu significativamente os tempos de acoplamento em comparação com a abordagem sintética atual. Além disso, os reagentes de condensação do tipo fosfônio facilitaram a condensação do fragmento do PMO, sintetizando até 8-meros contendo todas as quatro nucleobases com notável eficácia de acoplamento. Este é o primeiro relatório sobre a síntese convergente de PMOs. Esta abordagem facilitaria a síntese em larga escala de PMOs e aceleraria a sua popularidade e acessibilidade como terapia de próxima geração.

A abordagem antisense atraiu a atenção dos pesquisadores como uma potencial terapia futura para controlar a expressão de genes relacionados a doenças1,2,3. Oligonucleotídeos morfolino fosforodiamidato (PMOs), com ligações internucleotídicas não iônicas e uma estrutura morfolino, são considerados medicamentos antisense promissores . A alta afinidade de ligação ao mRNA4 alvo, especificidade de sequência6,7, solubilidade em água6 e baixa toxicidade do PMO7,8,9,10 foram confirmadas em estudos anteriores. Até o momento, quatro medicamentos antisense para a distrofia muscular de Duchenne foram aprovados (Exondys 51®11, Vyondys 53®12, Viltepso®13, Amondys 45®14) e espera-se que mais medicamentos PMO sejam aprovados no futuro. Além disso, um novo análogo de PMO denominado oligonucleotídeos tiofosforamidato morfolino (TMOs) foi sintetizado e mostrou potencial como um novo candidato a medicamento na terapia antisense . Os rápidos avanços nos PMOs aumentaram a necessidade de desenvolvimento de abordagens eficientes para a síntese de PMOs e análogos de PMOs. Particularmente, a abordagem sintética, que pode sintetizar PMOs em larga escala de uma só vez, é necessária para a disponibilidade de terapia antisense aos pacientes. Até o momento, muitas abordagens sintéticas foram desenvolvidas. A primeira abordagem sintética para PMOs foi relatada por Summerton e Weller5 (Fig. 1-A). Nesta abordagem, os nucleósidos de morfolino contendo uma porção N, N-dimetilaminoclorofosforamidato no grupo 5'-hidroxi e um grupo tritil (Tr) no grupo amino foram utilizados como unidades monoméricas (A). Os PMOs foram sintetizados repetindo a condensação do grupo 5'-N,N-dimetilaminoclorofosforamidato do monômero (A) com o grupo amino na extremidade 3' do oligômero após remoção do grupo Tr na extremidade 3'5. Esta abordagem é amplamente utilizada, mas tem vários problemas reconhecidos, incluindo baixa reatividade dos monômeros e longos tempos de reação para completar a reação de condensação. Em 2012, Harakawa et al. descobriram que a adição de LiBr a uma mistura de reação era eficaz e resultava em uma aceleração considerável da reação (melhoria de cerca de dez vezes) . Além disso, Li et al.17 descobriram que ao aumentar a temperatura da reação para 90 °C, a reação de condensação foi concluída em 8 min, permitindo-lhes sintetizar um 18mer-PMO em apenas 3,5 h usando um reator de fluxo. Kundu et al.18 relataram a síntese de PMO utilizando oligossintetizador automatizado. Neste relatório, uma síntese em fase de solução de 3-mer PMO foi alcançada usando a química Fmoc. Além disso, PMOs de 30 mer foram sintetizados por um sintetizador de DNA.

Abordagens atuais para a síntese de derivados de PMO.

Recentemente, Langner et al.15 relataram uma nova abordagem sintética para a síntese de TMOs utilizando derivados de fosforodiamidita como monômeros (Fig. 1-B). Em contraste com o PMO, os TMOs possuem ligação fosforotioamidato, que mostrou propriedades promissoras como oligonucleotídeos antisense. Os TMOs mostraram alta afinidade de ligação ao RNA e alta estabilidade de nuclease. Além disso, os TMOs quiméricos exibiram o seu potencial como inibidores de microRNA. 1-B, esta abordagem emprega derivados de morfolino fosforodiamidita contendo um grupo 4,4'-dimetoxitritil (DMTr) no grupo 5'-hidroxi (B) como unidades monoméricas. O processo de síntese envolveu a condensação de um monômero de morfolino fosforodiamidita (B) com o grupo hidroxila na extremidade 5' do oligômero na presença de um ativador ácido, como 5-etiltio-1H-tetrazol (ETT), seguido de sulfurização de um intermediário fosforamidita (C). A destritilação subsequente seguida por ciclos de síntese repetitivos produziu TMOs. O rendimento de acoplamento relatado foi de 95-97%, com um tempo de reação de condensação de 5 min15. Embora esta abordagem seja eficaz para sintetizar TMOs, não é aplicável à síntese de PMOs. Este método deu o derivado de fosforamidita (C) como intermediário, mas a partir deste intermediário, a ligação fosforodiamidato desejada do PMO não é obtida.

 PyNTP > PyBOP. This could be due to the ability of leaving groups (HOBt or 3-nitro 1,2,4-triazole (NT)) and the structure of the phosphonium center26,27. However, in this method, PyNTP showed a better result for the condensation reaction. The lower NMR yield using MNTP was due to the formation of by-products. Due to the higher activity as a condensing reagent, the activation of 2c by MNTP might have led to the overactivation and caused inferior condensing efficacy. Thus, BOPCl, BOMP, and PyNTP were selected as condensing reagents for further investigation./p> 99%; therefore, the conditions in entry 4 were selected as optimal ones. With the optimized reaction conditions in hand, phosphorodiamidate 2-mers bearing other nucleobases were synthesized (entries 5, 6, and 7). All 2-mers were obtained in > 99% NMR yields, demonstrating that the reactions proceeded efficiently regardless of the specific nucleobase. Although dimethylamine in H2O solution was used as the optimized conditions, the hydrolysis of the H-phosphonamidate linkage was not observed. It is attributed to the much higher reactivity of dimethylamine than that of H2O to the chlorophosphoramidate intermediate. These results were in good agreement with the previous reports29,30./p>